科研丨东北农大 (IF：1683)： 宿主-微生物群相互作用介导的猪对炎症性肠病的抗性 (国人佳作)

　　科研丨东北农大 (IF:16.83): 宿主-微生物群相互作用介导的猪对炎症性肠病的抗性 (国人佳作)

　　本研究表明，随着潜在有益微生物的增加，肠道屏障逐渐稳定，M-DSS猪中部分PRR非激活状态得以维持。

　　背景：抗病表型与免疫调节功能和免疫耐受有关，对畜牧业和人类健康均有影响。微生物群在调节宿主机体免疫和自身免疫中起着至关重要的作用，然而宿主-微生物相互作用对抗病表型的影响尚不清楚。本研究通过多组学分析确定了两个猪品种在微生物组和宿主水平上抗病的潜在调节机制。

　　结果：建立和约克夏猪急性结肠炎模型，并对对照组和患病个体作比较。相比于相同营养和管理条件下的约克夏猪，表现出较强的抗病性，其疾病活动指数(DAI)和组织学活性指数(HAI)均较低。微生物群测序分析显示，两个品种的患病个体中潜在有害微生物Desulfovibrio、Bacteroides和Streptococcus富集。有必要注意一下的是，潜在有益微生物(如乳杆菌属、梭菌属、Eubacterium以及隶属Ruminococcaceae和Christensenellaceae的几个属)在患病中富集，并发现其与肠道屏障功能相关的微生物代谢物呈正相关。具体而言，吲哚衍生物和短链脂肪酸的浓度在患病中增加，表明其在保护肠道屏障方面具有有益作用。此外，在患病约克夏猪中观察到较低浓度的胆汁酸代谢物和短链脂肪酸，这与潜在有害微生物(如Bilophila和Alistipes)的增加有关。关于免疫反应的富集，固有层中CD4+ T细胞的增加改善了患病的宿主免疫反应，有助于维持Th2型免疫优势和免疫耐受模式，并在潜在有益微生物的帮助下控制过度炎症。在患病的约克夏猪中，更多属于免疫生物学过程的术语得到富集，包括Toll样受体信号、NF-κB信号、Th1和Th17型免疫反应以及潜在有害微生物和肠道屏障受损的增加。

　　结论：综上所述，两个猪品种的研究根据结果得出，宿主-微生物群相互作用以三种方式促进抗病表型：通过维持部分PRR非激活、维持Th2型免疫优势和免疫耐受模式以及恢复肠道屏障功能，从而保护猪免受结肠疾病的侵袭。

　　1猪品种表现出不同程度的抗病表型特征和约克夏猪明显不同的抗病表型可能与肠道菌群组成和宿主肠道生物学功能有关。对这个论点，必须首先确定和约克夏猪之间是不是存在明显的表型差异。因此，我们比较了对照和急性结肠炎模型(M-CON vs. M-DSS)以及对照约克夏猪和约克夏猪急性结肠炎模型(Y-CON vs. Y-DSS)(图1a)。为了更直观地比较2个猪品种，采用疾病活动指数(DAI)和组织学活性指数(HAI)评估对照组与DSS诱导的结肠炎模型的疾病活动性。相比于M-CON猪和Y-CON猪，M-DSS猪和Y-DSS猪的DAI和HAI均升高，证实实验性结肠炎模型建立成功。虽然在M-DSS猪和Y-DSS猪中都观察到损伤，但Y-DSS猪表现出更早和更严重的机体损伤，表现为高体重减轻、粪便稠度和便血评分以及广泛的粘膜疾病和隐窝丢失(P0.01)(图1b，c和g)。这些观察根据结果得出，两个猪品种之间的抗病性存在一定的差异。免疫表型的一个重要组成部分是结肠和脾脏(一种富有丰富淋巴细胞的免疫器官)在总体重中的比例。Y-DSS猪脾脏和结肠显著增大，结肠长度显著缩短(P 0.05)，表明引起了严重的炎症(图1d-f)。

　　a和约克夏猪分别灌胃CON(对照，无菌生理盐水)或DSS(100 mL水中4% DSS)，连续5天。第一次剂量为200 mL。b和约克夏猪的疾病活动指数(DAI)值与天数的关系图(n = 8个样本/组)。DAI值计算为(体重减轻率评分+粪便稠度评分+血便评分)/3。cDSS处理后和约克夏猪的组织学活性指数(HAI)值。DSS处理后和约克夏猪的d脾脏系数，e结肠系数和f结肠长度的比较(n = 8个样本/组)。g DSS处理后和约克夏猪的远端结肠炎症和组织病理学评分(n=5个样本/组)。比例尺：200 μm。数据以平均值±SEM表示，通过t检验做多元化的分析；显著性显示为*P 0.05，**P 0.01。

　　2结肠微生物群和代谢物在两个猪品种的对照和患病个体之间发生了重塑由于对表型特征的结果感兴趣，我们接下来试图确定两个猪品种的对照和患病个体中微生物群的细菌组成，以阐明所有组成的差异。个人会使用丰富度和Shannon指数来计算α-多样性作为物种多样性的衡量指标。Y-CON猪和Y-DSS猪之间的α多样性无差异，但M-DSS猪的多样性略低于M-CON猪(图2a)。与对照猪相比，患有DSS诱导的结肠炎猪在β多样性方面表现出显著差异。

　　众所周知，患有DSS诱导结肠炎的猪能改变肠道微生物群，本研究结果进一步支持了M-DSS和Y-DSS猪肠道细菌组成的显著变化(图2b)。为了进一步了解两个品种的对照和患病个体之间的微生物差异，我们评估了两个品种的结肠微生物群组成。根据品种和处理显著分离菌群的样品簇如图2c、d、e和补充图1所示。M-CON猪在结肠中具有不一样细菌门的多样化群落，而M-DSS猪显示出厚壁菌门增加，拟杆菌门和Spirochaetes大量减少(图2c)。

　　a比较对照、患病和患病约克夏猪肠道菌群observed OTUs及Shannon、Simpson和Chao1指数(n = 6个样本/组)。b对照、患病和患病约克夏猪微生物组成的主坐标分析图(PCoA)(n = 6个样本/组)。DSS处理后和约克夏猪c门、d科和e属水平的结肠微生物群相对丰度(n = 6个样本/组)。

　　Cladogram图、LDA分布、线性判别分析效应大小(LEfSe)分析DSS处理后a和b约克夏猪微生物丰度的差异(n=6个样本/组)。cM-CON vs. M-DSS和Y-CON vs. Y-DSS(n= 6)比较中差异微生物的维恩图。dM-CON vs. M-DSS和Y-CON vs. Y-DSS比较中差异微生物的倍数变化(n=6)。 两个品种的数据表明，共生菌可能在急性结肠炎的抗性中起及其重要的作用。基于细菌群落表型预测的结果与我们的实验结果相匹配(图4a)。革兰氏阴性菌是最常见的共生病原菌。在M-DSS猪中，革兰氏阴性菌丰度的急剧下降伴随着革兰氏阳性菌的增加(P 0.05)，表明潜在致病性降低。

　　此外，预测结果还表明，潜在致病性在M-DSS猪中降低，但在Y-DSS猪中增加。京都基因和基因组百科全书(KEGG)图谱被用于确定微生物组的功能(图4b)。在KEGG图谱中，微生物代谢途径被分为几个三级类别，其中脂多糖生物合成、鞘脂代谢、β-丙氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢和色氨酸代谢在两个品种中最为丰富。一些途径，如丁酸盐代谢在约克夏猪中富集。

　　为了进一步了解DSS处理后两个品种的代谢变化，对结肠内容物进行了非靶向代谢组学分析。在结肠代谢组鉴定出1578种化合物。通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)获得了精确结果，这表明DSS处理后结肠代谢物发生了显著变化(图5a)。每次比较的代谢物都是相互关联的(图5b)。对表达代谢物的倍数变化、t检验和变量重要性投影(VIP)过滤的单因素分析显示，中有51种代谢物差异显著，其中26种明显高于M-DSS猪，25种相比来说较低(图5c和补充图2)。与Y-CON猪相比，Y-DSS猪有93种代谢物差异显著，包括31种上调代谢物和62种下调代谢物(图5c)。

　　a采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对DSS处理后的和约克夏猪的代谢物组成做多元化的分析(n = 6个样本/组)。b对照与患病和约克夏猪之间代谢物的相关性(n = 6个样本/组)。cDSS处理后和约克夏猪结肠代谢物的变化(n = 6个样本/组)。 有趣的是，维恩图显示了两种比较之间共有10种差异代谢物(M-CON vs. M-DSS和Y-CON vs. Y-DSS)(图6a)。9种常见的差异代谢物在两个品种的对照和患病个体之间显示出相同的趋势；其余的代谢物Anilidine显示出相反的趋势。M-DSS猪的Anilidine明显高于Y-DSS猪，但Y-DSS猪的Aniridine明显低于相应对照(图6b)。

　　为了确定差异代谢物的功能，咱们进行了KEGG富集分析(图6c和d)，结果与微生物组功能基本一致。M-CON vs. M-DSS和Y-CON vs. Y-DSS比较中富集的常见途径包括亚油酸代谢、氨基酸生物合成、谷胱甘肽代谢和β-丙氨酸代谢。有必要注意一下的是，与β-丙氨酸代谢相关的显著差异代谢物在两个品种之间表现出相反的变化趋势。这些代谢物在M-DSS猪中增加，表明该途径激活，但在Y-DSS猪中减少。与M-CON猪相比，M-DSS猪中富集的特定途径是精氨酸生物合成、色氨酸代谢和抗生素生物合成。

　　具体而言，我们得知一些参与抗生素生物合成的中间代谢物(如鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-色氨酸)在M-DSS猪中明显地增加。在M-DSS猪中，参与色氨酸代谢的所有差异代谢物均显著上调(图6e)，这表明的代谢组可能通过增加色氨酸对宿主的可及性进行更好的适应性调整。与Y-CON猪相比，Y-DSS猪富集的特定途径是鞘脂代谢、硝基甲苯降解以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢。与Y-CON猪相比，Y-DSS猪中涉及这些途径的主要中间代谢物(如亚精胺、鞘氨醇和乙酸)均下调(图6e)。除了通过代谢组学鉴定的结肠小分子的相对浓度外，还对总短链脂肪酸(SCFAs)、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、异丁酸盐和异戊酸盐的绝对浓度进行了定量(图6f)。M-DSS猪的乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐明显高于M-CON猪(P0.05)，但Y-DSS猪低于Y-CON猪，这可能表明约克夏猪在急性结肠炎期间的自我调节能力相对较低。

　　Spearman相关系数(R0.50，P0.05)评估结肠微生物群与代谢物之间的相关性。在(补充图3a)中，主要观察到潜在有益微生物乳杆菌属、Eubacterium、Blautia、Ruminococcaceae_UCG_002和Christensenellaceae与乙酸盐、L-色氨酸、丁酸盐、苯甲酸和苯胺之间有正相关关系(0.58R0.93，P 0.05)。这些微生物及其代谢物参与氨基酸生物合成、抗生素生物合成、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢和色氨酸代谢。Spearman相关网络表明，潜在有益微生物可能有助于代谢物的恢复并维持正常肠道功能(补充图3c)。在约克夏猪(补充图3b)中，潜在有害微生物Veillonella、Alistipes、Bacteroides、Bilophila和Desulfovibrio与脂肪酰基、酚类、咪唑吡啶、异黄酮类、甾醇脂质、羧酸及其衍生物之间有负相关关系(0.58 R 0.96，P 0.05)，这些微生物及其代谢物参与抗生素生物合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丁酸盐代谢、亚油酸代谢、次级胆汁酸生物合成和β-丙氨酸代谢。根据微生物与上述代谢型之间的Spearman非参数秩相关系数构建相关网络(补充图3d)。潜在有害微生物与上述大多数代谢型呈负相关，包括N8-乙酰亚精胺、亚精胺、12-酮脱氧胆酸、nutriacholic acid、reserpic acid、kanzonol和戊酸盐等代谢物。这一些数据表明，约克夏猪肠道微生物的变化与代谢失调有关，并干扰了正常的肠道功能。

　　aM-CON vs. M-DSS和Y-CON vs. Y-DSS比较中差异代谢物的维恩图。b对照与患病和约克夏猪之间的常见差异代谢物。cM-CON vs. M-DSS、Y-CON vs. Y-DSS比较的差异通路维恩图。d利用对照与患病和约克夏猪(n = 6 个样本/组)之间显著差异代谢物进行通路富集分析eDSS处理后和约克夏猪的主要代谢途径存在非常明显差异。fDSS处理后和约克夏猪的短链脂肪酸(SCFAs)浓度(n= 8个样本/组)。

　　3和约克夏猪的肠道屏障功能对DSS处理的反应不同肠道屏障功能包括三个主要部分：机械屏障、生态屏障和免疫屏障。生态屏障的紊乱(微生物生态失调)通常会导致机械屏障和免疫屏障的功能障碍。为了探讨宿主结肠核心细菌保护机制，采用RNA-seq分析方法对两个品种的结肠基因表达谱进行定量。图7a显示了火山图，用于可视化表达基因在对照组、患病和约克夏猪之间的分布。与M-CON猪相比，M-DSS猪上调322个基因，下调159个基因；与Y-CON猪相比，Y-DSS猪中上调231个基因，下调174个基因(图7b)。

　　为了进一步探索免疫屏障和机械屏障在对照组与患病和约克郡夏猪之间差异调节的生物学过程，进行了GO富集分析(图7c-f)。与M-CON猪相比，与免疫有关的几个术语，如对细菌的反应、免疫反应、炎症反应、急性期反应、2型免疫反应、CD4阳性、α-β-T细胞活化、T-helper 1型免疫反应的负调控、CD8阳性的负调控、α-β-T细胞活化、抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应，Toll样受体信号通路和MyD88依赖性toll样受体信号通路均在M-DSS猪中富集。

　　通过qRT-PCR验证RNA-seq分析鉴定的TLR7和TLR8基因的表达趋势，该基因在M-DSS猪中下调(P 0.05)(图7d)。GO分析显示，与Y-CON猪相比，Y-DSS猪中属于免疫生物学过程和肠道结构的以下术语富集：对细菌的反应、炎症反应、抗菌肽介导的阳性抗菌体液免疫反应，Toll样受体4结合和免疫反应。一些途径在Y-DSS猪中富集，但没有在M-DSS猪中富集，如NIK/NF-κB信号通路调控和I-κB激酶/NF-κB信号通路正调控。

　　这些途径中的基因在Y-DSS猪中表现出强烈的上调(P 0.05)，约克夏猪的炎症反应加重。参与免疫反应的一些途径，包括白细胞介素-8分泌、白细胞介素-6分泌、肿瘤坏死因子反应、干扰素-γ反应和T-helper 17型免疫反应，也在约克夏猪中被激活。这些根据结果得出，Th17型免疫反应是具有炎症特性的自身免疫性疾病的重要驱动因素，在约克夏猪中占主导地位。将改变的基因与KEGG数据库进行匹配显示，IL-17信号通路在约克夏猪中富集(补充图4)。

　　a对照组、患病和约克夏猪之间差异表达基因的火山图。bDSS处理后和约克夏猪上调和下调差异表达基因数量。DSS处理后c-d和e-f约克夏猪差异表达基因的GO功能富集分析以及免疫和肠道结构生物学过程的qRT-PCR验证。

　　a免疫组化染色(IHC)显示对照和患病和约克夏猪(n = 4个样本/组)中CD4+T细胞，CD8+T细胞，IgA+B细胞和MAC387+巨噬细胞的数量和分布。b免疫细胞数量的定性比较。结果用积分光密度(IOD)表示。

　　a热图显示DSS处理后从和约克夏猪中分离的结肠匀浆液中与不同免疫类型相关的炎症细胞因子的变化(n=6个样本/组)。bqRT-PCR检测DSS处理后和约克夏猪模式识别受体(PRRs)的相对表达水平(n = 6个样本/组)。c证实DSS处理后和约克夏猪的自身抗体分泌。d为了评估机械屏障，通过ELISA法对DSS处理的和约克夏猪的紧密连接(TJ)蛋白进行定量分析。

　　在肠道内，结肠是最密集和代谢最活跃的群落(包括超过1013个单独的微生物细胞)的栖息地。尽管结肠炎病原菌促进了IBD的发展，但共生菌对于IBD易感性的降低也至关重要。从无菌小鼠的研究可以明显看出共生细菌的保护作用，这些小鼠比常规饲养的小鼠更容易发生DSS诱导的结肠炎。微生物群可能在肠道健康中起最大的作用，包括宿主免疫反应的成熟、防止肠道病原体增殖以及对特定药物的反应或修饰。

　　在本研究中，患病表现出轻微的机体损伤，表现为体重减轻、粪便稠度和便血评分值较低以及有限的粘膜疾病和隐窝丢失，这增强了人类对于微生物群变化是否与抗病性相关的兴趣。中重要的宿主-微生物相互作用可能对宿主生理和疾病表型至关重要。我们整合了菌群测序、代谢组学和转录组学来研究有助于抗病的宿主-微生物群相互作用机制。 在本研究中，对和约克夏猪的急性结肠炎模型所有结果进行了单独分析。

　　目前的研究表明，IBD是一种多微生物疾病，多种肠道微生物因子、异常免疫应答和肠粘膜屏障减弱导致了异常的宿主-微生物相互作用。有趣的是，这两个品种的疾病反应并不相同，尽管两者都表现出炎症。与许多先前对IBD中微生物群变化的评估一致，Y-DSS猪表现出厚壁菌门减少，而在Y-CON猪中拟杆菌门、变形菌门和Spirochaetes增加。然而，令人惊讶的是，在中没有观察到类似的变化。与约克夏猪相比，M-DSS猪表现出厚壁菌门增加，拟杆菌门和Spirochaetes显著减少。

　　在属水平上，可以清楚观察到更具体的转变。据报道，IBD患者结肠粘膜中拟杆菌和变形菌的流行率较高。我们的数据表明，拟杆菌和脱硫弧菌分别作为拟杆菌门和变形菌门的成员，在两个品种的患病个体中富集。然而，这些变化的程度与严重程度在中不如约克夏猪明显。这些细菌的增加是IBD相关生态失调的常见发现，表明这些细菌可能是潜在的有害微生物，并在疾病的发病机制中发挥作用。Bacteroidetes和Prevotella影响结肠炎严重程度的一种可能机制是通过硫酸酯酶去除粘蛋白中的硫酸盐导致粘蛋白降解。此外，脱硫弧菌作为一种硫酸盐还原菌(SRB)，可增加硫化氢的浓度，侵蚀肠道上皮。

　　因此，肠道菌群失调可能通过肠道屏障受损而导致炎症。在本研究中，在Y-DSS猪中观察到OCLN、CLDN-1和ZO-1水平下调，这与我们对肠道屏障改变与微生物作用的推断一致。因此，我们似乎有理由推断，约克夏猪中更严重的肠道屏障受损和更积极的细菌易位可能相互影响，共同加剧炎症。 Y-DSS猪生态失调的其他关键特征是Gammaproteobacteria、Bilophila、Veillonella、Sutterella、Alistipes和Prevotella富集，Blautia、Eubacterium、Dorea、Butyricicoccus和Lachnospiraceae减少。根据Spearman秩相关网络，我们得知约克夏猪结肠中Bilophila、Alistipes和Bacteroidetes增加与乙酸盐、脱氧胆酸和肉豆蔻酸变化呈负相关。耐胆汁微生物(Bilophila、Alistipes和Bacteroidetes)丰度较高，表明这些细菌可能是胆汁酸代谢紊乱的根本原因。作为支持性证据，参与胆汁酸代谢的牛磺酸和亚牛磺酸代谢在约克夏猪微生物群和代谢物的KEGG谱中均得到了富集。此外，Blautia、Eubacterium、Dorea、Butyricicoccus和Lachnospiraceae成员是短链脂肪酸的主要生产者。短链脂肪酸(特别是丁酸盐)对肠道免疫功能的调节和肠道炎症的抑制具有有益作用。

　　约克夏猪中这些细菌的消耗可能是降低短链脂肪酸浓度和扩大肠道炎症的影响因素；这些发现被炎症细胞因子水平和粘膜屏障功能的结果所加强。有必要注意一下的是，在M-DSS猪中，许多潜在的有益微生物如厚壁菌门的乳杆菌属、Ruminococcaceae、Eubacterium和Christensenellaceae都得到了增加。几种瘤胃菌科属和Eubacterium丰度增加可促进SCFA浓度的增加，从而保护肠道屏障功能并在宿主中发挥抗炎特性。此外，由于Christensenellaceae被认为是一种潜在的益生菌，与炎症和代谢相关疾病呈负相关，因此M-DSS猪中的Christensenellaceae较高丰度表明在中可能触发了对疾病的防御。然而，更有趣的发现是乳杆菌在中的作用。乳杆菌可表达色氨酸酶，是代谢色氨酸的最重要共生菌。乳杆菌可保护被致病菌破坏的肠上皮屏障的完整性，并减少潜在致病菌的数量。与其他研究一致，在中观察到机械功能的恢复和色氨酸代谢物的富集。

　　本研究的微生物群和微生物通路数据表明，能够最终靠调节共生菌以实现疾病缓解。 肠道微生物群可以对外源性未消化膳食成分进行厌氧发酵产生多种代谢产物，其能到达结肠以及进入宿主细胞并与宿主细胞相互作用，进而影响免疫和炎症反应。通过将代谢组学与微生物组测序分析相结合发现，结肠微生物群与代谢物之间有很强的相关性，显示吲哚衍生物、胆汁酸、SCFAs和其他代谢物的水平发生了变化。

　　先前的研究表明，特定类别的代谢物，尤其是胆汁酸、SCFAs和色氨酸代谢物与IBD的发病机制有关。我们观察到约克夏猪的SCFA浓度降低和牛磺酸与亚牛磺酸代谢的抑制，表现出了截然不同的趋势。在中，乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐的水平升高，这与原生微生物群的改变有关，减轻了粘膜炎症。此外，色氨酸代谢在中得到促进，这与乳杆菌和其他潜在有益微生物丰度的增加相对应，表明肠道微生物群能够大大减少色氨酸排泄，并向宿主释放更多的色氨酸。肠道共生菌可通过色氨酸通过促进结肠杯状细胞分化和诱导粘蛋白基因表达来改善DSS诱导的结肠炎。这些变化可能解释了与约克夏猪相比，的抗病性更高。

　　此外，与疾病活动度负相关的结肠代谢物多个方面数据显示，Y-DSS猪的苯胺和亚精胺降低，表明处于失控状态。M-DSS猪中苯胺含量增加，进一步支持了抵抗急性结肠炎的能力。综上所述，本研究的根据结果得出，鉴于肠道微生物群与代谢物之间的良好相关性，的有益肠道微生物可治愈结肠并恢复代谢物。 微生物群失调可直接引发肠道屏障功能障碍和免疫系统的不成熟。肠道屏障功能障碍也与炎症密切相关。

　　为了进一步研究两个猪品种肠道微生物群与宿主免疫反应和肠道屏障功能的潜在联系，对和约克夏猪的结肠进行了RNA-seq分析。GO分析显示，在和约克夏猪中，与免疫功能相关的途径富集，包括免疫反应、炎症反应和由抗菌肽介导的免疫反应，表明了外源性刺激的反应。尽管反应相似，但Y-DSS猪的结肠炎症反应比M-DSS猪更活跃。

　　具体而言，几种PRRs信号通路和下游炎症相关通路，如Toll样受体4结合、NOD样受体信号通路、NIK/NF-κB，I-κB激酶/NF-κB信号通路和促炎细胞因子分泌通路，在约克夏猪中富集，而不是在中。与GO富集结果一致的是，在Y-DSS猪中观察到部分NLR和TLR基因及其下游促炎因子增加，但未在M-DSS猪中观察到，且这一结果通过ELISA分析和实时PCR检测得到证实。据报道，PRRs(如TLR4、NOD1和NOD2)通过感知微生物相关分子模式(MAMP)来引发炎症反应。PRR具有区分潜在有益微生物和潜在有害微生物的功能，对宿主具有不一样的后果(炎症与免疫稳态)。

　　此外，最近的数据表明，宿主受体(PRRs)接受MAMP刺激背景决定了炎症和免疫反应的质量。众所周知，DSS会破坏肠道屏障的完整性，使共生菌群进入肠上皮。在Y-DSS猪中，随着潜在有害微生物(Spirochaetes)的增加，在肠道屏障损伤的情况下会接收微生物配体信号，因此可能激活PRRs信号通路和下游炎症相关通路。在M-DSS猪中，许多潜在的有益共生微生物增加(如乳杆菌)，这表明一些MAMP促进了有益结果。在这种情况下，与M-CON猪相比，TLR2、TLR3、TLR4、TLR8、NOD1和NOD2等PRRs表现出非活性，从而引起耐受反应。当然，一些PRRs，如TLR2是通过感知MAMP被激活的。通常，TLR2介导对革兰氏阳性细胞壁肽聚糖的免疫反应，但不影响NF-κB和MyD88的表达，形成有益的宿主免疫反应。因此，与约克夏猪相比，可能已进化出一种更成熟的策略来调节结肠微生物群的结构并操纵PRRs途径，由此减少炎症。 肠道微生物群有助于正常免疫的发展，但当其失调时能够最终靠对淋巴细胞的影响促进自身免疫并影响免疫屏障。GO分析显示Th17型免疫反应被激活，并且在Y-DSS猪中分泌了大量的促炎因子。

　　此外，Th1和细胞毒性CD8+ T细胞(Tc)细胞因子(IFN-γ和TNF-α)和Th17细胞因子(IL-17)增加，表明Y-DSS猪通过Th1、Th17和Tc免疫反应促进了细胞介导的免疫。关于与微生物群可能的相关性，Y-DSS猪的Prevotellaceae属增加，这能刺激IL-6、IL-8和趋化因子配体20(CCL20)的产生，并促进粘膜Th17免疫反应和嗜中性粒细胞募集。大多数TLR的刺激会导致Th1(而非Th2)分化。Y-DSS猪中一些NLR和TLR基因的水平升高，这与Th1和Th17型免疫反应的激活一致。此外，CD8+ T细胞水平在约克夏猪的固有层中明显地增加。虽然CD8+ T细胞建立了保护屏障，防止周围宿主细胞的攻击，但它们的增殖，表明许多病原体正在进行攻击。

　　越来越多的证据说明，结肠炎的特征是结肠CD8+ T细胞扩增。与Y-DSS猪中CD8+ T细胞的增加不同，M-DSS猪的CD8+ T细胞保持在稳态水平，但观察到CD4+T细胞增加。CD4+ T细胞反映免疫状态，其更高的水平表明了更好的免疫性能。CD4+ T细胞可分为Th1和Th2细胞，它们驱动不同的免疫反应。基因GO富集分析显示，CD4+ T细胞被活化且在中急性期反应上调，表明1型免疫反应炎症期的结束和Th2型免疫介导修复期的启动。CD4+ T细胞和Th2细胞因子的表征和定量也可能是支持我们解释Th2型免疫介导修复阶段启动的有力证据。

　　迄今为止，研究之后发现Clostridia簇IV和XVIII通过TLR2促进CD4+调节性T细胞(Treg)分化，植物乳杆菌D--丙氨酰化磷壁酸通过TLR2调节Treg细胞，这是炎症的负调节因子。此外，罗伊氏乳杆菌与色氨酸一起可将上皮内CD4+ T细胞重编程为耐受性免疫调节性T细胞。这些属(梭菌属、乳杆菌属)的相对丰度在M-DSS猪中均有所增加。

　　此外，色氨酸代谢和TLR2活化在M-DSS猪中得到了促进。这一些数据提供了一个可能的解释，即中的常驻细菌能调节免疫反应以保持耐受性并控制过度炎症反应。 IgA是一类主要的免疫球蛋白，可在包括肠道在内的粘膜组织中产生。在肠腔中，IgA以高浓度的聚合IgA形式产生。聚合IgA通过pIgR转运，pIgR在肠上皮细胞上表达并以SIgA的形式释放到肠腔中。虽然M-DSS猪和Y-DSS猪的pIgR、SIgA和IgA的水平均有所增加，但Y-DSS猪的变化更为显著，这表明约克夏猪的适应性免疫反应比民主更强。最近的研究表明，肠道机械屏障功能障碍与IBD之间有显著相关性。肠道机械屏障也与微生物群及其代谢物紧密关联。一方面，许多细菌产物通过激活TLR和NLR通路来调节肠道屏障功能。

　　另一方面，肠道中产生的微生物代谢物(如SCFAs、次级胆汁酸和吲哚衍生物)通过与免疫细胞相互作用直接影响肠道屏障的完整性。通过对机械屏障中结肠微生物群、代谢物和TJ蛋白的分析，进一步解释了约克夏猪的肠道机械屏障功能障碍和的肠道机械屏障恢复。在Y-DSS猪中，Blautia、Eubacterium、Dorea、Butyricicoccus和Lachnospiraceae的减少可能与SCFA浓度的降低有关，导致上皮屏障障碍。次级胆汁酸的减少可能会促进加剧肠道屏障功能障碍。在M-DSS猪中，乳杆菌的富集和色氨酸代谢的促进可能会增加吲哚衍生物水平，从而增强肠道屏障功能。同时，SCFA产量的增加可能是由于几种潜在有益微生物的增加，从而维持结肠OCLN和CLDN水平。此外，M-DSS猪中TLR2活性增加。TLR2通过蛋白激酶C(PKC)增强肠上皮屏障的完整性。这一些数据表明，在这种IBD模型中，肠道菌群结构的调整和代谢物的恢复可能对肠道屏障起到保护作用。

　　本研究通过 微生物组测序、代谢组学、转录组学和其他分析发现了不同抗病性的品种对宿主-微生物相互作用的影响(图10)。本研究表明，随着潜在有益微生物的增加，肠道屏障逐渐稳定，M-DSS猪中部分PRR非激活状态得以维持。M-DSS猪中CD4+T细胞增加，而Y-DSS猪没有，可能与乳杆菌和色氨酸代谢的增加有关，从而保持了Th2型免疫优势和免疫耐受模式。

　　此外，关联分析显示乳杆菌、Christensenellaceae、Eubacterium和SCFA浓度之间有正相关关系，表明短链脂肪酸在保护肠道屏障方面具有非消极作用。慢慢的变多的证据说明，宿主-微生物相互作用与IBD疾病进展有关。因此，本研究的结果可能有助于筛选与宿主健康相关的核心肠道微生物候选物，并支持将抗炎策略的思维从提高免疫力转向免疫抑制。

　　图10. 宿主-微生物群相互作用介导的和约克夏猪对炎症性肠病的抗性。

　　比较两个品种对疾病和炎症免疫刺激的反应表明，结肠微生物分类、功能和代谢物及其与宿主生理适宜性的相互作用与抗性有关。许多潜在的有益微生物，如乳杆菌、梭菌、Eubacterium以及几种Ruminococcaceae和Christensenellaceae属在患病中增加，这与微生物代谢物(包括吲哚衍生物和短链脂肪酸)的改善呈正相关，从而可能恢复肠道屏障。

　　此外，核心菌群丰度改变，部分PRR未激活得以维持，从而有效抑制了炎症反应。固有层中CD4+ T细胞的增加改善了宿主免疫反应的监督，有助于维持Th2型免疫优势和免疫耐受模式并控制过度炎症反应。在约克夏猪中，患病个体中胆汁酸代谢物和短链脂肪酸的浓度较低，这与潜在有害微生物(如Bilophila、Alistipes和Bacteroidetes)的增加以及潜在有益微生物(如Blautia、Eubacterium、Dorea、Butyricicoccus、Lachnospiraceae和Roseburia)的减少有关。约克夏猪中潜在有害微生物和肠道屏障受损的增加可能是激活PRRs的一个因素，从而丰富了Toll样受体4结合、NF-κB信号通路和T-helper 1型和17型免疫反应。